CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOACaptura de pantalla 2022 09 14 a las 10.27.10    

Variabilidad genética de virus RNA

Resumen de Investigación:

Nuestro grupo fue pionero en el descubrimiento de las cuasiespecies víricas (1978-1990), una estructura poblacional altamente compleja y dinámica, con implicaciones en evolución y patogenia. Nuestros resultados de los últimos 40 años han sido ampliamente confirmados por la aplicación de secuenciación masiva llevada a cabo en muchos laboratorios durante los últimos años. El genoma de una población de virus RNA es un promedio ponderado de miríadas de secuencias distintas, estrechamente relacionadas entre sí que cambian constantemente. La secuencia consenso (o promedio) que escribimos por conveniencia, y que llena libros de texto y bases de datos, es una abstracción que ni tan siquiera puede que exista en la población que trata de representar. Recientemente hemos obtenido evidencia de una nueva clase de selección positiva que denominamos “selección ampliamente diversificadora” y que proporciona un repertorio muy amplio de genomas víricos con fitness replicativa comparable, a pesar de una historia de replicación prolongada en el mismo ambiente celular. Las nubes de mutantes dinámicas están preparadas para responder a ambientes cambiantes mediante la selección de ciertas subpoblaciones de genomas preferentemente sobre otras, un proceso 4esencial para la progresión de la enfermedad vírica. Actualmente, tratamos de relacionar acontecimientos evolutivos a nivel de cuasiespecies (dentro del hospedador) y epidemiológico (entre hospedadores), una relación que es importante para el diseño de agentes antivíricos efectivos.

La dinámica de cuasiespecies requiere nuevos abordajes para la prevención y el tratamiento de las enfermedades víricas asociadas a virus RNA, para contrarrestar la capacidad adaptativa conferida por los espectros de mutantes.

Estamos trabajando en el desarrollo de nuevas estrategias antivirales que eviten la selección de virus mutantes que escapen al tratamiento. El trabajo se está realizando con varios virus patógenos y recientemente con el hepacivirus virus de la hepatitis C (VHC) como modelo principal. Colaboramos con varios grupos para ampliar la perspectiva de nuestro trabajo: con Nuria Verdaguer (IBM, CSIC); con  Pablo Gastaminza (CNB, CSIC); Celia Perales (IIS, Fundación Jiménez Díaz); Josep Quer (Hospital Vall d’Hebrón);  Aurora Sánchez (IIB, CSIC-UAM); Juan Carlos Saiz y Alejandro Brun (INIA).

Durante los últimos años, nuestro énfasis ha sido en el VHC dada su  magnitud como problema de salud pública a nivel mundial y la directa implicación de su dinámica de cuasiespecies en enfermedad hepática y respuesta a tratamientos. Las principales contribuciones de nuestro grupo al VHC han sido: (i) la naturaleza multigénica de la resistencia a interferón; (ii) preparar poblaciones de VHC de distinto fitness para estudiar el efecto del fitness en la biología del VHC; (iii) que el fitness vírico es un determinante de multi-resistencia a drogas en ausencia de mutaciones específicas de resistencia; (iv) la ausencia de equilibrio poblacional (distribución estable de mutaciones y estasis fenotípica) incluso tras multiplicación prolongada del virus en un ambiente celular constante y (v) el diseño de tratamientos secuenciales y de combinación usando agentes antivirales mutagénicos y no-mutagénicos, con el objetivo de suprimir la infectividad (Figura 1). Estas investigaciones continúan actualmente. La colaboración con el grupo de la Dra. Celia Perales del IIS, Fundación Jiménez Díaz, resulta esencial para relacionar resultados con el HCV en cultivos celulares con observaciones con pacientes infectados.

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Figura 1. Resumen gráfico de nuestro trabajo reciente acerca de implicaciones de cuasiespecies y mutagénesis letal de virus RNA. El panel de la izquierda ilustra las olas mutacionales (identificadas mediante un color) de VHC cuantificadas mediante clonaje molecular-secuenciación Sanger y por secuenciación masiva, durante la multiplicación del virus en un ambiente biológico constante. Las ondas dibujadas se han identificado por los dos métodos, lo que excluye que se deban a un efecto de muestreo. Los paneles de la derecha ilustran la base conceptual de la mutagénesis letal con un ejemplo de extinción del VHC (arriba), un diseño de pases seriados (en medio) y extinción del VHC asociado a tratamiento con ribavirina (abajo). Información detallada está en las referencias indicadas y en la lista bibliográfica.

La mutagénesis letal es un campo de investigación en expansión que ha abierto un nuevo capítulo de la farmacología antiviral. Nuestro trabajo, en colaboración con el lamentablemente ya fallecido John Holland (UCSD), proporcionó la primera evidencia experimental del efecto negativo del aumento de tasa de mutación provocado por mutagénesis química en la supervivencia de virus RNA (1990-1997). En nuestro cribado actual de nuevos agentes mutagénicos aceptados para uso en humanos, hemos demostrado que el agente antiviral de amplio espectro favipiravir (T-705) es mutagénico para VHC y el VFA y puede extinguir estos virus. Hemos colaborado con los grupos de Juan Carlos Saiz y Alejandro Brun (INIA) para mostrar que favipiravir es mutagénico para los virus del Oeste del Nilo y de la fiebre del Valle del Rift, y que puede extinguir los virus. Un problema crucial no resuelto es la integración de inhibidores mutagénicos y no-mutagénicos en diseños para combatir enfermedades asociadas a virus RNA.

Hemos descubierto un nuevo mecanismo de escape del VFA a mutagénesis letal por ribavirina y 5-fluorouracilo, consistente en la selección de mutantes víricos que pueden modular la incorporación de nucleótidos de manera que se evita el sesgo mutacional que a menudo producen los nucleótidos mutagénicos. Este mecanismo no modifica la amplitud del espectro de mutantes y su correspondiente flexibilidad adaptativa. Interesantemente, una mutación comodín (es decir, aquella que se repite cuando el virus se somete a presiones selectivas distintas) en la proteína no-estructural 2C moduló también la incorporación de nucleótidos como respuesta a la mutagénesis por ribavirina, en ausencia de mutaciones en la polimerasa vírica. Estas observaciones ponen de relieve los múltiples recursos adaptativos que tienen los virus RNA para responder a ambientes hostiles y justifican nuestros esfuerzos en busca de diseños antivirales para inhibir fuertemente la multiplicación de los virus.

En una conexión interesante entre la expansión de los virus en la naturaleza y la evolución clonal de organismos, hemos propuesto para virus una distinción entre recombinación mecanísticamente activa pero inconsecuente y la recombinación evolutivamente relevante. Basado en la evidencia disponible, pensamos que mutación y recombinación ocurren continuamente durante la replicación de virus RNA pero que la mayoría de genomas mutantes y recombinantes no sobreviven (están sometidos a selección negativa). No obstante, hay subconjuntos de mutaciones que, en combinación con eventos puntuales de recombinación biológicamente relevante, contribuyen a la supervivencia de los virus y a su evolución (Figura 2). Estos estudios también están contribuyendo a un entendimiento más profundo de los acontecimientos a nivel molecular que subyacen a procesos de enfermedad vírica.

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Figura 2. Representación esquemática de la evolución clónica de virus. A partir de una infección inicial (Origin, abajo) se generan múltiples sub-linajes. La recombinación tiene lugar en cada rama (dobles flechas perpendiculares a las ramas). La diversificación biológicamente relevante se ilustra mediante ramas rojas y azules. Recombinación en un punto de discontinuidad (doble flecha grande vertical) es relevante biológicamente porque genera genomas mosaico con nuevos fenotipos. La evolución clónica continúa hasta que se alcanza un nuevo punto de discontinuidad. El esquema no implica una escala de espacio o tiempo. Reproducido de Perales et al. 2015, con permiso de la Academia Nacional de Ciencias de los EEUU.

Nuestro objetivo principal es usar el nuevo entendimiento de dinámica viral que ha sido proporcionado por el marco de la teoría de cuasiespecies para encontrar nuevas maneras de inhibir la multiplicación viral. Es nuestra convicción que los nuevos diseños antivirales podrán aplicarse al control de virus patógenos ya establecidos así como a virus emergentes y re-emergentes (Figura 3).

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Figura 3. Un resumen del abordaje y objetivo principal de nuestra investigación.

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ApellidosNombreLaboratorioExt.*e-mailCategoría profesional
Domingo SolánsEsteban1214540edomingo(at)cbm.csic.esDoctor Vinculado "Ad Honorem"
Somovilla CrespoPilar1214541psomovilla(at)cbm.csic.esInvestigador
Uribe-Echeverría EcheverriEsther1214541Estudiante TFM

Publicaciones relevantes:

  • Ojosnegros, S., Beerenwinkel, N., Antal, T., Nowak, M.A., Escarmís, C. and Domingo, E. (2010). Competition-colonization dynamics in an RNA virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 107, 2108-2112.
  • Agudo, R., Ferrer-Orta, C., Arias, A., de la Higuera, I., Perales, C., Pérez-Luque, R., Verdaguer, N. and Domingo, E. (2010) A multi-step process of viral adaptation to a mutagenic nucleoside analogue by modulation of transition types leads to extinction-escape. PLoS Pathog., 6(8): e1001072.
  • Ojosnegros, S., García-Arriaza, J., Escarmís, C. Manrubia, S.C., Perales, C., Arias, A., García-Mateu, M. and Domingo, E. (2011). Viral genome segmentation can result from a trade-off between genetic content and particle stability. PLoS Genetics, 7(3): e1001344.
  • Moreno, E., Ojosnegros, S., García-Arriaza, J., Escarmís, C., Domingo, E. and Perales C. (2014). Exploration of sequence space as the basis of viral RNA genome segmentation. Proc Natl Acad Sci USA, 111(18): 6678-6683.
  • De Ávila, A.I., Gallego, I., Soria, M.E., Gregori, J., Quer, J., Esteban, J.I., Rice, C.M., Domingo, E., Perales, C. (2016). Lethal mutagenesis of hepatitis C virus induced by favipiravir. PLoS ONE, 11 (10): e0164691.
  • Moreno, E.; Gallego, I.; Gregori, J.; Lucia-Sanz, A.; Soria, M. E.; Castro, V.; Beach, N. M.; Manrubia, S.; Quer, J.; Esteban, J. I.; Rice, C. M.; Gomez, J.; Gastaminza, P.; Domingo, E.; Perales, C. (2017). Internal Disequilibria and Phenotypic Diversification during Replication of Hepatitis C Virus in a Noncoevolving Cellular Environment. J. Virol., 91 (10), e02505-16.
  • de la Higuera, I.; Ferrer-Orta, C.; de Avila, A. I.; Perales, C.; Sierra, M.; Singh, K.; Sarafianos, S. G.; Dehouck, Y.; Bastolla, U.; Verdaguer, N.; Domingo, E. (2017). Molecular and Functional Bases of Selection against a Mutation Bias in an RNA Virus. Genome Biol. Evol., 9 (5), 1212-1228.
  • De la Higuera, I., Ferrer-Orta, C., Moreno, E., De Avila, A.I., Soria, M.E., Singh, K., Caridi, F., Sobrino, F., Sarafianos, S.G., Perales, C., Verdaguer, N., and Domingo, E. (2018). Contribution of a multifunctional polymerase region of foot-and-mouth disease virus to lethal mutagenesis. J. Virol. 92(20). pii: e01119-18.
  • Gallego, I., Soria, M.E., Gregori, J., de Ávila, García-Crespo, C., Moreno, E., Gadea, I., Esteban, J., Fernández-Roblas, R., Esteban, J.I., Gómez, J., Quer, J., Domingo, E., Perales, C. (2019). Synergistic lethal mutagenesis of hepatitis C virus. Antimicrob Agents Chemother. pii: AAC.01653-19. doi: 10.1128/AAC.01653-19.
  • Gallego, I., Soria, M.E., García-Crespo, C., Chen, Q., Martínez-Barragán, P., Khalfaoui, S., Martínez-González, B., Sanchez-Martin, I., Palacios-Blanco, I., de Ávila, A.I., García-Cehic, D., Esteban, J.I., Gómez, J., Briones, C., Gregori, J., Quer, J., Perales, C., Domingo, E. (2019). Broad and dynamic diversification of infectious hepatitis C virus in a cell culture environment. J.Virol. JVI.01856-19; doi: 10.1128/JVI.01856-19.

Tesis doctorales:

Un total de 26 tesis doctorales dirigidas o co-dirigidas. Se indican solo a partir de 2012.

  • Héctor Moreno Borrego (2012). Dinámica poblacional del virus de la coriomeningitis linfocitaria del ratón en su interacción con agentes mutagénicos. Universidad Autónoma de Madrid. Directores: Esteban Domingo y Verónica Martín.
  • Ignacio de la Higuera Hernández (2014).Factores determinantes del reconocimiento de nucleótidos en el virus de la fiebre aftosa. Universidad Autónoma de Madrid. Director: Esteban Domingo.
  • Ana Mª Ortega Prieto (2014).Mutagénesis letal del virus de la Hepatitis C. Universidad Autónoma de Madrid. Directores: Esteban Domingo y Celia Perales.
  • Elena Moreno del Olmo (2017). Evolución a largo plazo de virus RNA en ambiente biológico constante. Universidad Autónoma de Madrid. Directores: Esteban Domingo y Celia Perales.

Patentes:

  • N. Sevilla, E. Domingo, C. Escarmís, S. Ojosnegros, J. García-Arriaza, M. Sanz-Rojo, T. Rodríguez. "Vacuna atenuada para la fiebre aftosa". Nº DE SOLICITUD: P200801583. Patente concedida en España el 16/06/2011. Nº PUB: ES2344875.

Otras actividades:

  • Miembro extranjero de la Academia Nacional de Ciencias de Estados Unidos (2020).
  • Académico Numerario de la Real Academia de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, adscrito a la Sección de Ciencias Naturales, (2011).
  • Miembro de la Red Española de Biofísica, coordinada por el Dr. David Reguera, desde 2011.
  • Miembro del Global Virology Network, coordinado por el Dr. Robert Gallo, desde 2011.
  • Miembro del Comité Organizador del Congreso FEMS 2011 (Ginebra, Suiza, 2011).
  • Editor asociado de la revista Virus Research desde 2012.

Proyectos en marcha:

  • Estudio de las secuelas moleculares en la célula hospedadora tras la erradicación del virus de la hepatitis C en cultivo celular. SAF2017-87846-R. Financiado por: Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Investigador Principal: Pablo Gastaminza y Esteban Domingo. (2018-2020). Convocatoria: PN2017 - Programa estatal de i+d+i orientada a los retos de la sociedad - Plan estatal de investigación científica y técnica y de innovación 2013-2016.
  • Plataforma para el desarrollo de estrategias de control de salud animal. PLATESA2, S2018/BAA-4370. Financiado por: Comunidad de Madrid/FEDER. Coordinador: Noemí Sevilla. IP grupo VIRNA: E. Domingo. (2019-2022). Convocatoria: CM -Convocatoria de ayudas para la realización de programas de actividades de I+D entre grupos de investigación de la Comunidad de Madrid (CM) en Tecnologías 2018.
  • Búsqueda de cDNA del virus de la hepatitis C. BFU2017-91384-EXP. Financiado por: Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Investigador Principal: Celia Perales. (2018-2020). Convocatoria: PN2017 – Proyecto Explora - Subprograma estatal de generación de conocimiento - Programa estatal de fomento de la investigación científica y técnica de excelencia 2013-2016.
  • Combinaciones de antivirales frente al SARS-CoV-2. CSIC-COV19-014. Financiado por: Agencia Estatal CSIC. Investigador Principal: Nuria Verdaguer. (2020-2021). Convocatoria: Ayudas CSIC-COVID-19.

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